Cell-based assay

신호 전달 기작에 관련된 많은 단백질들이 현재 밝혀졌으며 상호기작에 관한 연구가 활발히 이뤄지고 있습니다. 그러나 신호 전달 기작에서 연결된 단백질 간의 관계를 보다 완전하게 이해하기 위해서는 시간과 공간의 정보가 필요합니다. 이러한 정보는 실시간 이미징 기술의 발달로 비약적인 성장을 하고 있으며 특히 2008년 노벨화학상을 받은 분야인 녹색 형광단백질 (Green fluorescent protein, GFP)은 발견 이후 생명공학연구 분야에 있어 분자 이미징과 같은 바이오-모니터링의 핵심기술로 사용되고 있습니다. 실시간 세포영상뿐만 아니라 최신 FRET 분석 기법으로 세포내 신호기전 분석을 지원하여 연구에 새로운 통찰력과 차별화된 영상 결과를 얻어 향후 환자에서 응용하는 등 지속적인 중개 연구를 수행하고 있습니다.
제공서비스

1. 실시간 세포영상
타겟 단백질의 세포내 운동성을 영상, 세포내 Ca2+, Zn2+, Lysosome, ROS, pH 등의 변화를 실시간 영상

2. FRET 프로브를 이용한 세포내 신호 기전 실시간 영상
세포내 다양한 신호기전을 FRET 기법을 이용하여 영상 (smallGTPase 들의 실시간 활성화, 세포내 small molecule 들 (ATP, cAMP, Ca2+, Zn2+, ROS, NADH 등)을 실시간 영상, 다양한 protein kinase들의 활성을 실시간 영상, 세포막에 조성 변화 (phosphoinositide들, PA, PS)를 실시간 영상)

기존 신호전달기전연구의
문제점

1. 단백질-단백질 상호작용 연구의 문제점
현재 많은 신호 전달 기작은 GST-pulldown, co-IP, Yeast two-hybrid system, IF 등을 이용하여 증명하고 있다. 여전히 이러한 기법은 단백질-단백질 간의 interaction을 밝히는데 유용하다. 그러나 완벽한 단백질 간의 상호작용을 이해하기 위해서는 시공간적 정보가 필요하다. 이러한 정보는 실시간 이미징 기법이 반드시 필요하다.

2. 현미경의 분해능 한계
일반적으로 사용되어지는 형광 현미경은 분해능이 약 200 nm이며 고 해상도의 공초점 현미경은 150 nm임으로 단백질-단백질 간의 상호작용을 연구하기에는 부족하다. 따라서 이러한 분해능의 한계를 해결하기위해서 FRET 기법을 도입함으로 해결 할 수 있다. FRET 신호는 약 10 nm 이내의 결합이 되어야 일어남으로 현미경 분해능의 한계를 넘을 수 있다.

3. 일반 라이브 이미징의 문제점
일반적으로 라이브 이미징은 타겟 단백질에 형광 단백질을 융합한 형태로 이미징을 함으로 단순 위치 변화의 정보를 얻을 수 있으며 실시간 이미징시 세포가 빠르게 움직이게 되면 형광 밝기가 변하므로 정확한 정보를 얻기가 어렵다. 따라서 이러한 문제점을 해결하기 위해서는 FRET-based indicator를 사용함으로 정확한 시공간적 정보를 얻을 수 있다. 그러나 FRET 기법을 활용하기 위해서는 많은 노하우가 필요하고 경험이 필요하다. 특히 최대값과 최저값간의 CFP와 YFP intensity의 ratio 차가 적은 poor dynamic range를 갖는 indicator를 사용 시 잘못된 정보를 얻을 수 있으므로 주의가 필요하다.

Fluorescence Resonance
Energe Transfer(FRET)이란

FRET이란 서로 스펙트럼이 중첩되는 한 쌍의 형광 물질이 서로 매우 근접하게 정렬될 때 두 개의 형광물질 사이에 무방사 에너지 전이 (radiation-less energy transfer)가 생기는 현상. 1997년 최초로 cameleon이라는 Ca2+ FRET indicator (CFP-Calmodurin-M13-YFP의 단분자 (intramolecular) FRET indicator)의 개발로 세포내의 Ca2+ 변화를 실시간 모니터링이 가능하게 되었고 그 이후 여러 가지 신호 기작 관련 단백질들의 FRET indicator들이 개발 되고 있음.

실시간 세포 이미징
Long-term imaging
단일 형광 실시간 이미징
실시간 FRET 세포 영상 예시
Calcium imaging
PKA activation
AMPK activation
ATP imaging
PI(3,4,5)P3 imaging
PI(4,5)P2 imaging
세포 사멸 FRET 이미징